光遗传学技术，这一篇就够了【适合初学者】
光遗传学（optogenetics）是一项整合了光学、软件控制、基因操作技术、电生理等多学科交叉的技术。自2005年，斯坦福大学Karl Deisseroth实验室通过在神经细胞中表达光敏蛋白，响应不同波长的光刺激实现对神经功能的调控，宣布人类正式拥有了精准操控大脑的工具。长久以来，我们对复杂的神经网络连接的理解仅停留在相关性上，有了光遗传学，我们终于有能力，微创、精准地探究特定的神经环路和大脑功能之间的关系，这无疑是个跨越式的进步，下面我们就详细地了解一下这门技术。[视频彩蛋在文末]
1. 绿色荧光蛋白的发展：1962年，下村脩从水母中发现了绿色荧光蛋白（GFP），正式开启了生物发光研究的大门，从此以后，科学家通过改造和筛选，获得了更强，荧光种类更丰富的荧光蛋白来作为生物体的标记，用荧光的办法使生物体内发生的变化可视化。2008年，绿色荧光蛋白获得了诺贝尔化学奖。
图1. 运用荧光蛋白带来的最典型、最绚烂的研究——脑虹（Braibow）
2007年，Joshua R. Sanes 和Jeff W. Lichtman主持的一项研究将红黄蓝三种颜色的荧光色素嵌入小鼠基因组，成功地为小鼠的不同细胞涂上不同颜色。三种颜色相互组合，最终展现在显微镜下的老鼠脑干组织切片上有近百种颜色标记，如同一道绚烂的彩虹。
脑虹让我们清楚地看到了大脑内不同细胞交织在一起的绝妙画面，也带来了更深一层的问题——这些细胞之间，是怎么互相作用的呢？在经典的生物学实验中，控制神经细胞需要一些比较粗暴的手段，电刺激、切脑区、或者是加一些化学物质。费时费力不说，达到的实验效果也并不尽如人意。长久以来，神经学家们一直梦想着，能够以精确的时空精度控制神经元活动。这个梦想被光遗传学实现了。光遗传学的灵感实际上来自我们的视觉。人眼中有重重的感光细胞，外界的光线进入我们的眼睛，在视网膜后转变为化学信号和电信号，通过神经元的传输进入大脑。那我们是不是也可以通过光来给神经元下命令，操控它们的活动呢？
2. 2005年——光遗传学不被认可的开始：，斯坦福大学的Edward S Boyden和Karl Deisseroth教授（文末视频主讲者）通过使用慢病毒载体将一种莱茵衣藻的蛋白质ChR2 (Channelrhodopsin-2) 转染到神经元中，实现动作电位与突触传导的兴奋/抑制性控制。然而这样一项开拓性的工作却接连被Nature和Science杂志拒稿，最终即使被Nature Neuroscience接收, 其工作的实用性也遭到了质疑。
3. 2005至今——光遗传学的发展和完善：尽管光遗传学一出现就遭遇了坎坷，但随着与光学的紧密结合，这种以微生物产生的视蛋白为基础的光遗传学操控被广泛应用。对神经环路的研究物种发展到了线虫、果蝇、斑马鱼、啮齿动物等。光遗传学的出现使科学家对神经环路的研究更加可控，特别是当随机检测一个神经元对于神经环路的意义时，光遗传学已经逐渐成为无脊椎动物研究行为基础的神经环路的标尺。即使目前无法完全理解任何感觉、行为和认知的过程，但科研工作者们已经尝试应用光遗传学来绘制信息流形成的大脑图谱，例如结合fMRI(functional magnetic resonance imaging, 功能性磁共振成像)或者PET(postron emission tomography，正电子辐射断层成像)的前沿技术对特定神经细胞产生的活动模式进行全脑范围的成像。随着光遗传学方法和技术的不断发展与完善，光遗传学被科学界广泛认可，2010年被Nature Methods选为年度方法，同年被Science认为是近十年来的突破之一。
图2. 2005年至今光遗传相关的论文数量 (Nature Neuroscience，2015，18:1213-1225)
1. 神经元膜内外的离子分布：我们知道，当神经元处于静息状态时，细胞膜两边存在着电位差，这被称为静息电位。静息电位的产生是由于膜内外各种离子的分布不均衡，以及细胞膜蛋白对各种离子的通透性不同造成的。
2. 光遗传学原理：首先运用工具病毒载体，将光感基因（如ChR2，eBR，NpHR3.0，Arch或OptoXR等）转入到神经系统特定类型的细胞中进行特殊离子通道或GPCR的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，如Cl-、Na+、H+、K+，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。
3. 光遗传蛋白应用举例：例如，对于ChR2来说，当有473nm的蓝色激光照射时，这些通道蛋白的通道打开，允许阳离子（如Na+）大量内流，产生动作电位，即让神经元处于兴奋状态。对于NpHR来说，当有580nm的黄色激光照射时，这些通道蛋白的通道打开，允许Cl-通过，使神经元一直处于静息电位，即让神经元保持静息状态。
图3. 光遗传蛋白的作用原理——利用离子通道的对离子的选择性调节细胞的兴奋性
相比起传统的研究方法，光遗传学有着无可比拟的优点。它只需要向细胞内转入一个蛋白，实际操作性高；以光作为刺激媒介，可实现神经细胞的毫秒级操控；利用光遗传技术观察神经投射；通过组织特异性启动子实现特定细胞的调控；对实验动物的创伤远远小于传统方法，且没有异物侵入组织；可以用定位的光纤来局部刺激细胞，也可以设计弥散光大范围刺激脑区。利用光遗传学技术进行研究主要包括以下4个步骤：
光敏蛋白可分为激活型和抑制型两种，能够引起神经元兴奋或抑制。其光灵敏度和动力学之间存在负相关，激活或抑制能力强弱与时间的精准控制密切相关，所以，根据光敏感蛋白的不同特性寻找合适的光敏感蛋白是首要步骤。
利用转染、病毒注射或转基因动物等方法将编码光敏感蛋白的基因输入到靶细胞中，其中，病毒注射是光遗传学研究的主导手段，主要采用慢病毒和腺相关病毒AAV。
可采用导入光纤或控制激光的方式将光导入研究区域，选择不同的参数（波长、光强度、频率和占空比）进行光刺激，来达到对神经元活动的时间调控；通过选择性地照射细胞局部的方法来实现对神经元活动的空间调控。
一般采用电极记录神经元细胞膜内外的电压变化，并可用荧光性生物传感器来检测不同细胞数值，通过电生理记录或行为学测试等方法，将光刺激对神经元、神经回路或动物行为的改变呈现出来。
图4. 光遗传学实验的基本步骤（以ChR2为例）
光遗传蛋白经过多年的发展，激活型和抑制型蛋白均发展出几种不同的突变型，可以根据自己的激光器和实验需求进行选择，下面简要介绍。
激活型通道蛋白：
1. ChR2(H134R)：ChR2的突变体，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度也比野生的ChR2慢了一倍。该突变体是运用最广的一种类型；
2. ChR2(C128S/D156A): ChR2的突变体，超灵敏光敏感通道，用蓝色激光打开通道，然后用绿色或黄色激光关闭通道，可以打开其离子通道长达30分钟；
3. ChR2(E123T/T159C): ChR2的突变体，更大的光电流和更快的动力学变化；
4. ChETA：ChR2的突变体，使得神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道蛋白只能达到40Hz；
5. C1V1：由ChR1及由团藻发现的VChR1组合在一起的通道蛋白，在红色激光刺激下打开通道，该通道蛋白类型更利于双光子激发；
6. ReaChR：能在大脑深处或透过头盖骨激活。
抑制型通道蛋白：
1. NpHR：即为Halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，会聚集在内质网上，而如果将内质网输出元件加在NpHR基因序列后面，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的NpHR被称为eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的NpHR被称为eNpHR3.0；
2. Arch：即为archaerhodopsin，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元处于超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。在特定条件下，可用于增加细胞内pH或减少细胞外基质pH。和NpHR相比，当激光关闭的时候，Arch立即从通道打开状态恢复到关闭状态。
3. Mac:即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，蓝色激光激活的质子泵，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元保持超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。
1. 抑制某个神经环路：首先在野生型小鼠脊髓背侧的神经元，以AAV为载体表达抑制性光敏蛋白NpHR，在臂旁核区域安装激光器并发出黄光，这样就可以将脊髓-臂旁核环路抑制，然后观察小鼠的行为学改变。
图5 光遗传抑制脊髓-臂旁核的投射能够明显抑制药物诱导的搔痒行为
2. 兴奋某个神经环路：首先构建GRPR神经元特异诱导表达的小鼠，在小鼠脊髓背侧的GRPR神经元注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，使ChR2特异性表达在GRPR阳性神经元中，然后在GRPR阳性神经元处埋置激光器并发出蓝光以兴奋神经元，再在GRPR阳性神经元下级处（与臂旁核直接联系的神经元）记录电生理。这样就可以将GRPR阳性神经元与脊髓水平的臂旁核下级投射神经元胞体的神经环路联系在一起。
图6 光遗传学研究GRPR阳性神经元与脊髓的投射
近年来，虽然光遗传技术取得了瞩目的成就，但是依然有一些需要我们关注的问题。
1. 首先，有人认为光遗传学激活子和抑制子的标准用法存在瑕疵，对神经环路引入这样外源的兴奋或抑制的刺激可能使神经元应答超出生理范围，在这种情况下，神经环路会出现不自然的变化，最后导致不正确的生理学结论。
2. 其次，光敏蛋白的表达和光照在神经元群体中并不均匀，结果是光遗传学操纵的量级和范围会出现异质性，例如发生光的散射时。
3. 再次，大范围光刺激同时作用在神经元群体上，可能使环路出现非生理性的活动模式，例如靶向特化的某些细胞时产生的能量沉积等问题。
4. 另外，我们知道刺激表达光遗传学蛋白的轴突是一个常用的策略，不过直接用光刺激轴突boutons，可能会引起非生理性的神经递质释放，容易使人过高估计突触连接的影响。
5. 最后，有研究表明，不论是用病毒还是质粒电转，长期高水平表达ChR2都会造成轴突形态异常，这就让人怀疑光敏蛋白是否还会对神经环路的功能产生一些潜在的影响。因此，在光遗传学用于治疗人类疾病之前，我们必须开发更好的病毒体系，仔细评估病毒递送系统的长期安全性和有效性。
6. 由于神经细胞的轴突、树突互相交联，光敏蛋白的响应信号很容易就干扰到周边的神经细胞，因此需要开发一些仅表达在胞体上的光敏蛋白（新发表的光敏蛋白soCoChR）；另一方面，想要通过光遗传达到某一个细胞的精度很难实现（需要发展单细胞级的光遗传技术）。
7. 另一个更开放的问题就是这项技术如何应用到临床研究。因为我们现在仅仅掌握人类大脑里粗略的细胞类型和功能，要精确定位可作为临床研究靶点的神经细胞还需要更坚实的基础科学依据。当然，毫无疑问的是，通过光遗传学在基础神经科学中的应用，未来将会发现更多的供药物开发的分子靶点，更多的供计算机模拟人脑的环路位点，更多的供再生医学如修复人脑使用的方法策略。
作为光遗传学的先驱者以及透明脑技术CLARITY的发明者，美国加利福尼亚州斯坦福大学的神经科学家Karl Deisseroth在神经科学领域大名鼎鼎。2005年，轰动性的光遗传技术(optogenetics)文章，论文的一作是Edward S Boyden，二作则是我们颇为熟悉的CRISPR小王子张锋。下面是Edward S Boyden精彩演说，视频中展示了他如何用植入性光纤选择性地激活或抑制某一部分神经，通过这种史无前例的控制技术，他用来治疗患有创伤后应激障碍和某些程度失明的老鼠。猛戳视频↓↓↓
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